顾昌伟1，孙青芳2，诸江3，卞留贯2，赵卫国2，沈建康2，高恒1，冯东侠1

1江阴市人民医院国际协作江阴脑科中心，无锡 214400； 2上海交通大学医学院附属瑞金医院神经外科，上海 200025；3上海瑞金医院上海市血液学研究所，上海 200025

上海市自然基金资助（08ZR1413800）

摘要
背景：越来越多的迹象表明实体肿瘤来源于分化的肿瘤细胞和肿瘤干细胞。在所有的肿瘤细胞中具有干细胞特性的侧群细胞虽只占据较小的部分，却在肿瘤起始、生长、维持和复发过程中起着至关重要的作用。
目的：基于染料流出、克隆形成和多药耐药能力，从U87人脑胶质瘤细胞系中寻找潜在的干细胞样肿瘤细胞。
设计、时间和地点：细胞学和分子生物学体外实验在上海市血液学研究所和上海市内分泌学研究所完成，体内对照动物实验在交通大学医学院实验动物中心完成；实验于2007-06/2008-05完成。
材料：U87细胞系由中科院上海癌症研究所提供；DMEM/F-12(1:1)和胎牛血清购自美国Invitrogen公司；人碱性成纤维生长因子购自美国BD生物科学公司；Hoechst 33342、维拉帕米、噻唑蓝购自美国Sigma公司；PE标记抗人CD133购自德国Milteny生物科技公司；SYBR? PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）。
方法：体外单层培养U87 细胞系，0.25% Trypsin-EDTA消化后以1×106/mL浓度重悬于PBS中（含2%胎牛血清），用Hoechst 33342单独染色或同时加入维拉帕米，荧光激活细胞分选出侧群细胞和非侧群细胞，分别用含血清培养基和无血清培养基进行体外培养，以进行各项体外细胞检测。最后U87细胞、侧群和非侧群细胞皮下注入5周龄BALB/C-nu小鼠背部行体内致瘤实验。
主要观察指标：用倒置显微镜观察细胞增殖能力和克隆生成特性；使用MoFloTM流式细胞仪鉴定侧群细胞表型并行CD133荧光抗体标记分析；采用半定量实时RT-PCR对ABC转运体mRNA表达作相对定量；利用酶联免疫测定法通过MTT试验评价U87细胞系抗肿瘤药物能力；根据裸鼠成瘤大小评价U87细胞及其亚群致瘤特性。
结果：在体外传代培养中，人U87细胞系保持稳定的侧群表型，并形成神经球样克隆。与未经处理的U87细胞系相比，侧群细胞增殖活性相对低下。CD133在侧群和非侧群细胞中表达及其微量。新分选的侧群细胞表达高水平的ABC药物转运基因，呈现出更强的细胞毒药物抵抗性。裸鼠活体实验发现非侧群和U87细胞同样具致瘤能力，且非侧群细胞致瘤能力似乎更为强大。
结论：侧群细胞成分的含量是影响ABC 转运体mRNA 表达和细胞毒性药物耐药性的关键因子，更值得注意的是U87细胞系中，肿瘤干细胞或肿瘤起始细胞并非独一无二地富集于侧群细胞亚群中，非侧群细胞有时候更具致瘤性。

关键词：肿瘤干细胞；肿瘤起始细胞；侧群细胞；胶质瘤；CD133

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